Lumafluor公司的逆向示蹤產(chǎn)品RetroBeads是逆向示蹤熒光微球，且也是目前證實有效的示蹤微球，見Nature（310: 498-500 (1984)）等頂刊。該產(chǎn)品的有效性經(jīng)數(shù)百篇從無脊椎動物到哺乳動物實驗的研究論文證實，這正是靶點科技旗下Proven and Published®服務(wù)和產(chǎn)品質(zhì)量理念的體現(xiàn)。RetroBeads體內(nèi)注射高度集中不易擴(kuò)散，信號強(qiáng)，對活細(xì)胞或活體無毒，且存留時間大于一年，與大多順向示蹤劑、原位雜交檢測技術(shù)、免疫組化技術(shù)兼容。

訂購信息：

產(chǎn)品貨號：R180-100

產(chǎn)品名稱：Red Retrobeads IX Lumafluor逆向示蹤紅色熒光微粒

產(chǎn)品規(guī)格：100μL

現(xiàn)貨代理：靶點科技

英文信息：

R180 Red Retrobeads™ IX (100ul)

Highly confined injections--superb for detailed connectivity studies. Persist indefinitely (> 1 year!) in living cells, nontoxic. Compatible with most other anterograde tracers, in situ hybridization, and immunohistochemsitry.

貨號：R180

規(guī)格：100ul

品牌：Lumafluor

代理：Target Technology

激發(fā)發(fā)射譜：

Lumafluor  R180-100  Red Retrobeads IX Lumafluor逆向示蹤紅色熒光微粒

產(chǎn)品形態(tài)： 隨附的小瓶包含懸浮在蒸餾水中的濃縮珠溶液。如果紅珠用于逆行追蹤神經(jīng)元通路，則溶液可以按原樣使用或稀釋使用。在大鼠視覺皮層中，使用紅珠時，1:4 的稀釋度似乎不會降低逆行標(biāo)記的質(zhì)量或程度。但是，對于初始實驗，我們強(qiáng)烈建議使用溶液全強(qiáng)度。除蒸餾水外，標(biāo)準(zhǔn)鹽溶液（NaCl、KCl）也可用作稀釋劑。所提供的綠色珠子已準(zhǔn)備好用于逆行追蹤實驗。不建議稀釋綠色珠子。

產(chǎn)品儲存：珠溶液應(yīng)儲存在加濕容器中，在冰箱中，以防止蒸發(fā)。不要凍結(jié)！被凍結(jié)的珠子將無法工作，也無法挽救。如果珠子變干，它們就不能被重組。這種材料的保質(zhì)期尚未確定，但如果儲存得當(dāng)，它可以保持幾年的良好狀態(tài)。

產(chǎn)品應(yīng)用：最好使用壓力注射珠子（例如 1 毫升 Hamilton 注射器或加壓空氣注射系統(tǒng)）。對于局部電路工作，已通過具有 30-50 um 直徑的玻璃移液器注入非常少量 (30-50 nl)。對于常規(guī)逆行追蹤，使用更大體積 (0.1-0.3 ul) 和更大直徑的移液器吸頭。然而，即使注射量很大，珠子也不會擴(kuò)散到遠(yuǎn)離注射部位的地方（通常小于 1 毫米）。因此，為了標(biāo)記投射到大型結(jié)構(gòu)的所有或大部分神經(jīng)元，應(yīng)該進(jìn)行幾次注射。不建議將珠子的離子電滲應(yīng)用作為傳遞示蹤劑的有效方法。然而，珠子確實帶有凈負(fù)電荷。

生存時間：在大多數(shù)溫血脊椎動物系統(tǒng)中，注射后的最短有效生存時間約為 24 小時。標(biāo)記強(qiáng)度隨著存活時間的延長而增加，最長可達(dá) 48 小時。48 小時后，未觀察到標(biāo)記強(qiáng)度增加（或減少）。這些值在冷血動物中可能有很大不同，建議初始生存時間為一周。最長存活時間尚未確定，但即使在 14 個月的存活時間后，標(biāo)簽的質(zhì)量或范圍也沒有變化。單元格可能被標(biāo)記。未觀察到對動物或神經(jīng)元的毒性作用。

固定和處理：標(biāo)準(zhǔn)固定是用 0.1 M 磷酸鹽緩沖液洗滌，然后在 0.1 M 磷酸鹽緩沖液 (pH 7.4) 中加入 4% 多聚甲醛。戊二醛會產(chǎn)生大量的組織自發(fā)熒光，這可能會掩蓋珠標(biāo)記的神經(jīng)元，應(yīng)盡可能避免。綠色珠子在戊二醛固定材料中將看不見。將冷凍切片收集在磷酸鹽緩沖液中，安裝在涂有明膠的載玻片上，然后風(fēng)干。干燥后，可以將載玻片在二甲苯中清洗 1 分鐘，然后用 Fluoromount 或 Krystalon 蓋上蓋子。Fluoromount 購自 Atomergic Chemetals Corp., Farmingdale, NY；來自新澤西州吉布斯敦的 Harleco (EM Industries) 的 Krystalon。

短暫接觸酒精和二甲苯無害，但長時間接觸（超過 5 分鐘）會破壞珠子。珠子對甘油非常敏感，如果安裝在含甘油的溶液中會迅速褪色。在需要使用非長期性透明/固定劑的情況下，水楊酸甲酯優(yōu)于甘油。如果將載玻片保存在黑暗中，細(xì)胞中的標(biāo)記至少一年不會褪色（盡管背景自發(fā)熒光可能會顯著增加）。到目前為止，在塑料嵌入后保留珠子標(biāo)記的嘗試尚未成功。

顯微觀察：紅色珠子中的染料是羅丹明，因此可以使用任何用于羅丹明的熒光濾光片。一些較舊的尼康羅丹明濾鏡組會產(chǎn)生非常高的背景，這會使標(biāo)記的細(xì)胞不可見。使用 Zeiss 和 Leitz 標(biāo)準(zhǔn)羅丹明濾光片都獲得了良好的結(jié)果。對于綠色珠子，寬帶熒光素過濾器效果很好。路西法黃的濾光片組提供更強(qiáng)烈的信號，但以更高的背景為代價。窄帶熒光素濾光片會產(chǎn)生比寬帶濾光片弱得多的信號。即使經(jīng)過長時間的觀察或顯微攝影，珠子也不會明顯褪色。

使用低功率、低數(shù)值孔徑的干式物鏡（例如 X4、X10）通?？床坏綐?biāo)記。如果細(xì)胞被強(qiáng)烈標(biāo)記，X10 浸沒物鏡（數(shù)值孔徑為 0.4 或更大）或更高功率的干物鏡通常會顯示細(xì)胞。然而，X25 浸沒物鏡通常會顯示非常清晰標(biāo)記的細(xì)胞，而低功率物鏡會錯過這些細(xì)胞。這些警告尤其適用于綠珠。在決定實驗不起作用之前，請使用浸入物鏡檢查注射部位附近的部分。應(yīng)該存在許多局部標(biāo)記的細(xì)胞。

綠色微球注意事項：在迄今為止所做的工作中，似乎年輕的動物比年長的動物更好地傳遞信號。此外，年輕動物的組織自發(fā)熒光較低。因此，如果可能的話，建議在涉及綠珠的實驗中使用年輕的動物。

因為綠色珠子在比紅色珠子更短的波長下被激發(fā)，所以組織自發(fā)熒光是一個更大的問題。因此，盡量減少自發(fā)熒光將產(chǎn)生更好的對比度信號。減少自發(fā)熒光的方法包括： 

1) 使用更薄的切片（例如 30 um 而不是 40 或 50）；
2) 使用較年輕的動物；

3) 在蓋玻片后立即檢查切片（背景隨著時間的推移而增加）。